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南京信帆生物技術有限公司 |  資料大小 |
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僅用于科學研究,不能用于診斷
操作流程
明膠酶譜法的基本過程是先將樣品進行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子
存在的緩沖系統中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，后用考馬斯亮藍將
凝膠染色，再脫色，在藍色背景下可出現白色條帶，條帶的強弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
1. 樣本制備。
a. 細胞上清：
（1）取6孔板中對數生長期的腫瘤細胞，用無血清培養基沖洗3次，每孔中加入1ml無血清培養基，實驗分組，加入干預
因素，37°C、5%CO 恒溫培養箱中培養24h。
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（2）將細胞培養上清液移入離心管中，4°C、2000rpm離心10min，取上清分裝后–80°C保存備用。
（3）BCA法測定各樣品蛋白濃度，根據不同濃度確定樣品的上樣體積，保證各樣品上樣的蛋白質量相同，與4×上樣緩沖
液5µl混合，總體積不足20µl用三蒸水補足（可以根據制膠時孔的大小決定上樣總體積）。
b. 血清 : 取適量血清直接與4×上樣緩沖液等體積混勻 , 如酶活性太高造成顯帶不理想 , 可適當進行稀釋。
2. 參照表一配制10%分離膠（含1%明膠）和5%濃縮膠，制膠，等膠干之后，加入電泳緩沖液，使其溢滿上樣孔。
3. 上樣，4°C、100V進行SDS-PAGE 電泳，直至溴粉藍跑至分離膠的底部。
4. 電泳結束后，切取包括72KD和92KD合適大小的凝膠放置于洗脫液中振蕩洗脫4次，每次15min。
5. 漂洗液中震蕩漂洗2次，每次20min。
6. 孵育液中，37°C水浴鍋中孵育48h。
7. 染色液中搖床上震蕩染色3h。
8. 將凝膠置于脫色液中，震蕩脫色2h。
9. 脫色完成后，在藍色背景上，可見72KD和92KD處為白色條帶。
