在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，

     在一步法測定中，這些抗體就會與HEV 的多肽抗原結合，并固定在上面，洗板除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根過氧化物酶）酶結合物，ELISA試劑盒經第二次孵育后，酶結合物就會與*次孵育結合上的HEV IgM抗體相結合，洗板除去未結合的酶結合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育時會發生酶-底物反應，ELISA試劑盒只有那些含有HEV IgM抗體和酶結合物所形成的復合物的孔才會發生顏色變化，間接法也稱夾心法，是直接法的簡單改進，將酶示蹤物標記在二抗上，再與*抗體（已與相應抗原反應形成復合物的IgG）反應，然后進行顯色反應。此法要求第二抗體與特異性抗體（一抗）應是不同種屬的動物產生，如特異性抗體（一抗）是兔抗人IgG，酶標記抗體（二抗）則可以是羊抗兔抗體。

操作步驟如下：

1, 將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

2, 加受檢標本，保溫反應。ELISA試劑盒標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

3, 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。

4, 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。