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豬副豬嗜血桿菌12型（HPS-12）ELISA試劑盒
閱讀：125 發布時間：2021-1-4豬副豬嗜血桿菌12型（HPS-12）試劑盒（ELISA）
使用說明書
l 本試劑盒用于體外定性檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中豬副豬嗜血桿菌12型（HPS-12）。
l 有效期：6個月
l 保存條件：2-8℃
l 本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷
實驗原理
試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被豬副豬嗜血桿菌12型（HPS-12）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、陰性和陽性對照、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的豬副豬嗜血桿菌12型（HPS-12）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），判定陰陽性。
樣本處理及要求
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將*碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4. 細胞培養物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
需要而未提供的試劑和器材
- 酶標儀（450nm）
- 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
- 37℃恒溫箱
- 蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標板 | 96孔 | 48孔 | 無 |
陰性對照 | 0.3mL | 0.3mL | 無 |
陽性對照 | 0.3mL | 0.3mL | 無 |
* | 6mL | 3mL | 無 |
檢測抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無 |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說明書進行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無 |
底物B | 6mL | 3mL | 無 |
終止液 | 6mL | 3mL | 無 |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無 |
說明書 | 1份 | 1份 | 無 |
自封袋 | 1個 | 1個 | 無 |
注意事項
- 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
- 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
- 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
- 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。
- 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。
- 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
- 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
- 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
- 不能使用過期產品。
- 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
試劑準備
試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
- 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
- 設置陰性對照孔、陽性對照孔和樣本孔，陰性、陽新對照孔各加50μL對照品；
- 樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
- 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
- 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
- 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
- 每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。
實驗結果計算
1. 陰性對照OD值：小于0.2。
2. 陽性對照OD值：大于0.8。
3、陽性判斷（Cut-Off值）：陰性對照OD值+0.15，樣本OD值大于閾值，判定為陽性，反之，為陰性。