elisa檢測試劑盒免疫共沉淀原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇zui后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。
二、準(zhǔn)備工作：
預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī)
1. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，zui后一次吸干PBS；
2. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1ml/107個細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶，0.5ml/5×106個細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶)
3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15min（EP管插冰上，置水平搖床上）
4. 4℃，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中
5. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景
7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月）
9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 μg/μl）
10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異
11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育
12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）
13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時(shí)候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS
14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）
15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。
elisa檢測試劑盒
2-氯-5-甲基吡嗪 CAS號： 59303-10-5 進(jìn)口、組裝
2-甲基-6-三氟甲基苯胺 CAS號： 88301-98-8 進(jìn)口、組裝
3-溴噠嗪 CAS號： 88491-61-6 進(jìn)口、組裝
N-BOC-3-環(huán)己酮胺 CAS號： 885280-38-6 進(jìn)口、組裝
6-溴-1H-吲唑-4-甲酸 CAS號： 885523-08-0 進(jìn)口、組裝
2-氯嘧啶-5-羧酸乙酯 CAS號： 89793-12-4 進(jìn)口、組裝
7-碘吲哚 CAS號： 89976-15-8 進(jìn)口、組裝
3,5-二氟芐胺 CAS號： 90390-27-5 進(jìn)口、組裝
2-氯吩噻嗪 CAS號： 92-39-7 進(jìn)口、組裝
對羥基聯(lián)苯 CAS號： 92-69-3 進(jìn)口、組裝
反式-2-己烯-1-醇 CAS號： 928-95-0 進(jìn)口、組裝
吲哚-3-甲酸甲酯 CAS號： 942-24-5 進(jìn)口、組裝
(5-氟吡啶-2-基)硼酸 CAS號： 946002-10-4 進(jìn)口、組裝
3-氨基呋喃-2-甲酸甲酯 CAS號： 956034-04-1 進(jìn)口、組裝
1,2,4-*基苯 CAS號： 95-63-6 進(jìn)口、組裝
2-甲硫基-4-溴嘧啶 CAS號： 959236-97-6 進(jìn)口、組裝
elisa檢測試劑盒
會員1.png)