說明該試劑盒以 HRP 標記的鏈霉親和素復合物（HRP Streptavidin Conjugate，
HRP-SA）為基礎，可用于檢測血液,細胞、組織內(nèi)的特異性 CD40 抗原。該試劑盒
具有靈敏度高、特異性強、定性定位準確、背景清晰。在所用的 CD40 一抗與相
應靶抗原結合后，用生物化二抗與一抗特異性結合，zui后加入 HRP-SA，形成抗
原—特異一抗—*化二抗—HRP-SA 復合物，顯微鏡下觀察成像。
試劑盒所含試劑：
試劑 A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（選用）
試劑 B 封閉緩沖液（封閉用） 20 mL
試劑 C （*分裝）已稀釋的即用型 CD40 一抗（2.5ml）
試劑 D （*分裝）*化羊抗兔 IgG 1 支
（濃度 1.5 mg/mL，稀釋比為 1:300~1:500）50 μL+抗體稀釋液 20ml
試劑 E HRP-SA 復合物 1 支（濃度 1 μM，稀釋比 1:50~1:200）100 μL試劑 F DAB 顯色液 5ml
用戶自備試劑：1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三羥基氨基甲烷 1.21g
加蒸餾水 800mL，濃鹽酸調(diào) pH 值至 7.2~7.4，zui后定容至 1000mLTBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）
2．抗原修復液（依檢測抗原不同而選擇不同的修復液）10mM pH6.0 檸檬酸緩沖檸檬酸 0.38g檸檬酸三鈉 2.45g加蒸餾水 900mL，濃鹽酸調(diào) pH 值至 6.0，zui后定容至 1000mL或：0.5M EDTA 修復液（pH8.0）EDTA·2H2O 186.1g蒸餾水 700mL，用 10mM NaOH 調(diào) pH 值至 8.0，zui后定容至 1000Ml
3. 緩沖甘油封固劑 10 mL
4. Tween 20 5 mL 石蠟包埋組織切片免疫染色實驗步驟（建議方案 ）：
石蠟包埋組織切片 3~4μm 厚度
1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于 60℃恒溫烤箱中至少烤 1 hr；
2.脫蠟： 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟 3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；
3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇 5min，95%乙醇 2 次（每次 2min），85%乙醇 2 mi75乙醇 2min，自來水沖洗，ddH2O 洗 2×2min；
4.抗原修復： 根據(jù)抗體說明書*方法進行抗原修復，常采用高壓、微波（溫度達到 98~100℃）或消化修復法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O 洗 2×2min，TBS 洗滌（2×2min）（具體修復方法見附 1）* 注：有些抗原勿需修復，直接進入第 5 步封閉。
5.封閉： 滴加試劑 B，37℃濕盒孵育 30 min；
6.加一抗：滴加用試劑 C（即用型一抗），37℃濕盒孵育 2 hr；
7.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
8.封閉： 滴加試劑 B，37℃濕盒孵育 10 min；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的*化二抗（試劑 D），37℃濕盒中孵育
30 min；
10.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
11.封閉： 滴加試劑 Tween 20，37℃濕盒孵育封閉 20 min；
12.加 HRP-SA： 滴加用試劑 C 稀釋的試劑 E（1：50~200，終濃度 5~20 nM），37℃濕盒中孵育 30 min；
13.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min），TBS 洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應用 DAB 溶液（試劑 F）顯色；
15.復染：自來水充分沖洗，復染，脫水，透明；
16.封片： 待組織標本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。
注意事項：
1. 修復后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導致
結晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復使
用。
3. 若試劑為微量濃縮液，用前應低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用 TBS 充分洗滌，以便洗去組織上殘留的 Tween 20，否則會
影響結果觀察。
5. 如須復染細胞核，則在封片前復染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。
附 1：抗原修復方法
常用抗原修復液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）、EDTA 抗原修復液（pH8.0 或9.0）等等。
一、酶消化修復法酶消化修復
切片脫蠟水化處理，TBS 沖洗，在組織上滴加*或*，37℃孵育20~30min 后 TBS 沖洗即可。
二、微波抗原修復法
微波盒中加入抗原修復液微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔或繼續(xù)微波 10~15min，取出微波盒冷卻至室溫后，自來水沖洗，取出切片。因不同微波爐微波處理時間存在差異，須自行調(diào)整。
三、直接高壓抗原修復法
取修復液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰，將組織切片置于耐高溫切片架上，修復液沸騰后放入切片架，蓋上鍋蓋，待噴氣后計時 1.5~2.5min 即可脫離熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。
四、隔水式高壓抗原修復法
不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰，微波盒中加入修復液于微波爐中加熱至沸騰，將切片放入微波盒中，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋，待噴氣后計時4~8 min 即可關閉熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復。
