往預先包被人程序性死亡分子-1(PD-1)捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人程序性死亡分子-1(PD-1)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

3. 細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。

5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

酶標儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱

操作注意事項

試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正?，F象，水浴加熱使結晶*溶解后再使用。
實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
預處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。
嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
所有液體組分使用前充分搖勻。

操作步驟

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
設置標準品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；
隨后標準品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體50μL，，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
所有孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷

繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

人程序性死亡分子-1ELISA檢測試劑盒性能

1. 準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值，大于等于0.9900。

2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 ng/ml。

3. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4. 重復性：板內、板間變異系數均小于15%。

5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6. 有效期：6個月