逆轉(zhuǎn)錄PCR的注意事項

時間：2024/12/17閱讀：152

1、雙鏈DNA的變性溫度是由雙鏈中C+G的含量決定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解溫度就越高。在選擇的變性溫度下，模板鏈越長變性所需時間就越長。如果變性溫度過低或變性時間過短，會使僅僅富含A+T區(qū)域變性。當(dāng)模板DNA的G+C含量超過55%的時需要更高的變性溫度。

2、復(fù)性過程采用的溫度至關(guān)重要如果復(fù)性溫度太高，寡核苷酸引物不能與模板很好的復(fù)性，擴增效率將會降低。如果復(fù)性溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性的DNA片段的擴增。復(fù)性通常在比理論計算的引物和模板的溶解溫度低3—5℃的條件下進行。

3、PCR擴增所需的循環(huán)數(shù)目決定于反應(yīng)體系中起始的模板拷貝數(shù)以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應(yīng)進入幾何級數(shù)的增長期，反應(yīng)會一直持續(xù)下去，直至某一成分成為限制因素。從這一點上來說，擴增產(chǎn)物中絕大多數(shù)應(yīng)該是特異性的擴增產(chǎn)物，而非特異性的擴增產(chǎn)物應(yīng)該低到難以檢測到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率為0.7）在一個含有10的5次方個拷貝的靶序列的反應(yīng)體系中進行30個循環(huán)后往往可以做到上述的理想情況。

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