PCR步驟及循環(huán)參數(shù)

時(shí)間：2021/10/8閱讀：3078

　　PCR步驟：1. DNA變性

　　(90℃-96℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

　　2. 退火

　　(25℃-65℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

　　3. 延伸

　　(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈

　　PCR的循環(huán)參數(shù)：

　　1. 預(yù)變性(Initial denaturation)

　　模板DNA*變性與PCR酶的*激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。

　　2. 循環(huán)中的變性步驟

　　循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不*，易造成擴(kuò)增失敗。

　　3. 引物退火(Primer annealing)

　　退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。

　　退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。

　　4. 引物延伸

　　引物延伸一般在72℃進(jìn)行(Taq酶最適溫度)。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略

　　延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。

　　5. 循環(huán)數(shù)

　　大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

　　6. 最后延伸

　　在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘.使引物延伸*，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

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