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ELISA間接法和夾心法
這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無(wú)色或近于無(wú)色者判為陰性,顯色清晰者為陽(yáng)性。但在ELSIA中,正常人血清反應(yīng)后??沙霈F(xiàn)呈色的本底,此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異,因此實(shí)驗(yàn)中必須加測(cè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物(見3.6)。在用肉眼判斷結(jié)果時(shí),更宜用顯色深于陰性對(duì)照作為標(biāo)本陽(yáng)性的指標(biāo)。目視法簡(jiǎn)捷明了,但頗具主觀性。在條件許可下,應(yīng)該用比色計(jì)測(cè)定吸光值,這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本(sample,S)、陽(yáng)性對(duì)照(P)、和陰性對(duì)照(N)的吸光值,然后進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法有多種,大致可分為陽(yáng)性判定值法和標(biāo)本與陰性對(duì)照比值法兩類。
a. 陽(yáng)性判定值
陽(yáng)性判定值(cut-off value)一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù),以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定,試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化,陽(yáng)性和陰性的對(duì)照品應(yīng)符合一定的規(guī)格,須配用精密的儀器,并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽(yáng)性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對(duì)大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)而得到的?,F(xiàn)舉某種檢測(cè)HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對(duì)照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿,陽(yáng)性對(duì)照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng/ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測(cè)得A值后,先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均數(shù)(NCX)和陽(yáng)性對(duì)照A值的平均數(shù)(PCX),兩個(gè)平均數(shù)的差(P-N)必須大于一個(gè)特定的數(shù)值(例0.400),試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)≥0.5×NCX,并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范圍,則棄去,而已另兩個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX;如有兩個(gè)陰性對(duì)照A值超出以上范圍,則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。陽(yáng)性判定值按下式計(jì)算:
陽(yáng)性判定值=NCX+0.05 標(biāo)本A值>陽(yáng)性判定值的為陽(yáng)性,小于陽(yáng)性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是,式中0.05為該試劑盒的常數(shù),只適合于該特定條件下,而不是對(duì)各種試劑均可通用。
根據(jù)以上敘述可以看出,在這種方法中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用,試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會(huì)產(chǎn)生"試驗(yàn)無(wú)效"的后果。
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