人胚肺二倍體細胞HEL-1細胞 現(xiàn)貨*                          

【實驗?zāi)康摹?/p>

1.學(xué)習(xí)Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理。

2.掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的方法和操作。

【實驗原理】

   蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與Folin-酚試劑起氧化還原反應(yīng)。反應(yīng)過程分為兩步，*步：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物；第二步：蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍色的化合物。該呈色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)即接近極限，并且在一定濃度范圍內(nèi)，藍色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。進行測定時要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測定波長：若蛋白質(zhì)含量高時（25-100μg）在500nm波長處進行測定，含量低時（5-25μg）在755nm波長處進行測定。zui后根據(jù)預(yù)先繪制的標準曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。

Folin-酚試劑法操作簡便，靈敏度高，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測得，是測定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得zui廣泛的方法之一。

【實驗材料】

1.實驗器材 人胚肺二倍體細胞HEL-1細胞 現(xiàn)貨*

100毫升容量瓶  2只；移液管  1毫升4支，5毫升2支；721型分光光度計。

2.實驗試劑

（1） Fo1in-酚試劑甲：將lg碳酸鈉溶于50ml 0.lmol／L氫氧化鈉溶液中，再把0.5g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶于100m1 1％酒石酸鉀（或酒石酸鈉）溶液，然后將前者50ml與后者lml混合。混合后1日內(nèi)使用有效。

（2）Folin-酚試劑乙：在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）、25g鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）、700ml蒸餾水、50ml 85％磷酸及100ml濃鹽酸，充分混勻后回流10h。回流完畢，再加150g硫酸鋰、50ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴，冷卻后定容到1000ml。過濾，如顯綠色，可加溴水?dāng)?shù)滴使氧化至溶液呈淡黃色。置于棕色瓶中暗處保存。使用前用標準氫氧化鈉溶液滴定，酚酞為指示劑，以標定該試劑的酸度，一般為2mol／L左右（由于濾液為淺黃色，滴定時濾液需稀釋100倍，以免影響滴定終點的觀察）。使用時適當(dāng)稀釋（約1倍），使zui后濃度為lmol／L酸。

（3）標準蛋白質(zhì)溶液：用分析天平精密稱取牛（或人）血清白蛋白100毫克，用少量蒸餾水*溶解后，轉(zhuǎn)移至100毫升容量瓶中，準確稀釋至刻度，使蛋白質(zhì)濃度1mg/ml。

（4）樣品溶液：配制約0.5mg/ml的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。

【實驗操作】

1. 繪制標準曲線

取7支試管，按下表分別加入各試劑

試劑        \   管號0123456

標準蛋白質(zhì)溶液（ml）0.00.10.20.30.40.50.6

蒸餾水（ml）1.00.90.80.70.60.50.4

Fo1in-酚試劑甲（ml）5555555

搖勻，室溫下放置10分鐘 人胚肺二倍體細胞HEL-1細胞 現(xiàn)貨*

Fo1in-酚試劑乙（ml）  111  1111 各管加入Fo1in-酚試劑乙后，立即搖勻，放置30分鐘后比色，在500nm處記下各管光密度，以0號管為對照，以光密度為縱坐標，標準蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2. 測定未知樣品：取2支試管，分別準確吸取1毫升樣品溶液，各加5毫升Fo1in-酚試劑甲，搖勻，室溫放置10分鐘后，再各加1毫升Fo1in-酚試劑乙，立即搖勻，放置30分鐘，在500nm處測定光密度值。   

【實驗結(jié)果】

根據(jù)未知樣品溶液的光密度值，在繪制好的標準曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。