人NK 細胞克隆的制備

基本原理
NK 細胞克隆來源于NK 細胞，該細胞的分離方法參見*節之四。這些NK 細胞與經γ射線照射的飼養細胞苓而獲得的NK 細胞克隆。

試劑和材料
● 植物血凝素（PHA）母液為100μg/ml
● 重組IL－2（rIL－2）母液為105u/ml，分裝小瓶（0．5ml/瓶），置－20℃長期保存，或置4℃下短期存放。應避免反復凍融，IL－2 不能用濾器過濾除菌處理。
● 培養基
1.接種培養液：RPMI1640＋10％FCS＋0．5μg/ml PHA＋200u/ml IL－2＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml 鏈霉素＋1mmol/L 丙酮酸鈉。
2.飼養細胞培養液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml鏈霉素＋1mmol/L 丙酮酸鈉。
3.NK 克隆培養液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml 鏈霉素＋1mmol/L 丙酮酸鈉，經0．2u 濾板過濾再加入100u/ml IL－2。
4.培養液：RPMI1640＋10％FCS。
● 飼養細胞：自體或同種異體PBMC
● 器皿和儀器：96 孔細胞培養板、多頭移液管、微量移液管、倒置顯微鏡、CO2 孵箱、低溫離心機、垂直氣流超凈臺

實驗操作
1.NK 細胞的制備
1） 制備NK 的方法參見*章之第四節。
2） 懸浮NK 于接種培養液中，細胞濃度調至106/ml。
2.接種NK 細胞
1） 制備飼養細胞（PBMC）方法參見*章*節。

人小細胞肺癌細胞DMS 153  
人胚肺細胞 VA13細胞WI-38 VA13亞系 2RA  
人胚肺二倍體細胞HEL-1  
人胚肺細胞系KuMA  
人肺轉化細胞系AE1201    
人肺鱗癌細胞NCI-H226  
人胚肺二倍體細胞HEL-2  
人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B  
人胚肺轉化細胞SL-1  
人肺腺癌細胞Calu-3  
人小細胞肺癌細胞NCI-H209  
人低分化肺腺癌細胞GLC-82  
人小細胞肺癌細胞NCI-H446  
人非小細胞肺腺癌細胞NCI-H157  
人肺鱗癌細胞NCI-H520  
人肺巨細胞癌高轉移細胞株PG-BE1  
人肺巨細胞癌低轉移細胞株PG-LH7  
人肺癌細胞A-427  
人低分化肺腺癌細胞SK-LU-1  
人肺支氣管癌細胞NCI-H1650  
人非小細胞肺腺癌細胞NCI-H1975  
人非小細胞肺腺癌細胞NCI-H2087  
人小細胞肺癌細胞NCI-H2227  
人非小細胞肺癌細胞NCI-H23  
人肺腺鱗癌細胞NCI-H596  
人非小細胞肺癌細胞NCI-H838 

2） 于4℃用300×g 離心飼養細胞12min。
3） 被離心的飼養細胞懸浮于飼養培養液中，細胞濃度調至2×106/ml。
4） 用強度5000radγ射線照射飼養細胞，于4℃用300×g 離心飼養細胞12min，將離心細胞再懸浮于飼養細胞培養液中，飼養細胞濃度調至2×106/ml。
5） 在6 塊96 孔培養板的各孔中加100μl 上述飼養細胞懸液（總量用60ml 飼養細胞懸液，含1．2×108 個飼養細胞）。
6） 將96 孔板置37℃孵箱預溫，直到加入NK 細胞。
7） 將NK 細胞懸浮于接種培養液中，并于預溫的96 孔板中加入100μlNK 細胞，使成為10 細胞/孔、5 細胞/孔和2．5 細胞/孔的三種類型板，而且每種類型重復二塊板。
8） 將培養板置5％CO2 孵箱中37℃培養。
3.NK 細胞的再刺激（接種后2－3 天，主要依賴于飼養細胞）
1） 從每孔中輕輕移棄100μl 上清液。
2） 每孔中加入含有經照射的飼養細胞（2×106 細胞/ml）的NK 克隆培養液100μl。此培養液的制備方法如下：
（1） 融化飼養細胞，移至50ml 試管中。
（2） 輕輕地加入培養液30ml，混勻后用5000radγ射線照射飼養細胞。
（3） 用300×g 離心飼養細胞12min，并計數飼養細胞數量。
（4） 按細胞計數結果，將飼養細胞懸浮于NK 克隆培養液中，調至細胞濃度為2×106/ml。
4.換液（6－8 天）從每孔中輕輕移棄100μl 上清液，并加入新鮮NK 克隆培養液100μl。
5.檢測NK 細胞的生長狀況（9－10 天）如檢查有細胞生長，按第8 天的操作換液。
6.分離克隆（11－15 天）
1） 當培養液顏色變黃時，證明細胞已生長，在96 孔板上將生長的NK 按1 孔分為2 孔，2 孔分為4 孔，4 孔分為8 孔的方式分離克隆培養。
2） 在96 孔板上擴增克隆，并重復第7 天的操作。

人非小細胞肺癌細胞H125  
人肺癌細胞H1299  
人肺癌細胞TKB-1  
人肺腺癌細胞LTEP-a-2  
人肺腺癌細胞Lu-165  
人大細胞肺癌細胞NCI-H460  
人肺腺癌細胞SPC-A-1  
人高轉移肺癌細胞095-D  
人肺鱗癌細胞SK-MES-1  
人大細胞肺癌細胞NCI-H661  
人肺黏液上皮樣癌細胞NCI-H292  
人肺退行性癌細胞Calu-6  
人肺腺癌細胞NCI-H1395  
人非小細胞肺癌細胞NCI-H358  
人非小細胞肺癌細胞HCC827  
人典型小細胞肺癌細胞NCI-H1688  
人非小細胞肺癌細胞NCI-H1299  
人胚肺二倍體細胞2BS  
人支氣管上皮樣細胞BEAS-2B  
人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-1  
人胚胎氣管組織來源細胞CCC-HBE-2  
人肺腺癌細胞Calu-3  
人肺退行性癌細胞Calu-6  
人小細胞肺癌細胞DMS 153  
人高轉移肺癌細胞95-D  
人低分化肺腺癌細胞GLC-82  
人肺細胞HLF-a  

質控與提示
1.每天需檢查細胞生長情況。
2.NK 細胞克隆只生長在96 孔板上，NK 細胞總是用96 孔培養板進行克隆培養。
3.目前了解，鼠NK 細胞克隆的制備于短期培養。