凍存細(xì)胞 冷凍及解凍方法
一、細(xì)胞冷凍保存
1、材料：
生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO（Sigma D-2650）、無菌塑料冷凍保存管（Nalgene 5000-0020）、0.4％（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(jī)（KRYO10SeriesII）。
2、冷凍保存方法：
（1）傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時(shí)（或隔夜）→液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20℃不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
3、步驟：
（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。
（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，zui后濃度為5～10％，混合均勻，置于室溫下待用。
（3）依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液（約0.1ml）計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
（4）離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。
4、注意事項(xiàng)：
（1）欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好（logphase）且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。
（2）冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。
（3）注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無菌且無色（以0.22micron FGLP flon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650），以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。
（4）冷凍保存之細(xì)胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma：1～3×106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死去。
③adherent tumor lines：5～7×106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
（5）冷凍保護(hù)劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。
二、冷凍細(xì)胞活化
1、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。
2、細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常（例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì)）。
3、材料 ：37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器 。
4、步驟：
（1）操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
（2）自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí)蓋子易松掉。
（3）將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。
（4）取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。
（5）取出解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)（稀釋比例為1：10～1：15），混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。
（6）解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑（例如DMSO或glycerol），依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
（7）若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
通派生物（細(xì)胞庫）專業(yè)為您提供以下現(xiàn)貨細(xì)胞：
人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H661
人肺黏液上皮樣癌細(xì)胞NCI-H292
人肺退行性癌細(xì)胞Calu-6
人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1395
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H358
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827
人典型小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1688
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1299
人胚肺二倍體細(xì)胞2BS
人支氣管上皮樣細(xì)胞BEAS-2B
人胚肺成纖維細(xì)胞CCC-HPF-1
人胚胎氣管組織來源細(xì)胞CCC-HBE-2
人肺腺癌細(xì)胞Calu-3
人肺退行性癌細(xì)胞Calu-6
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞DMS 153
人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95-D
人低分化肺腺癌細(xì)胞GLC-82
人肺細(xì)胞HLF-a
人胚肺二倍體細(xì)胞HEL-1
人胚肺二倍體細(xì)胞HEL-2
人肺癌細(xì)胞H1299
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827
人胚肺二倍體細(xì)胞KMB-17
人胚肺細(xì)胞系KuMA
人肺鱗癌細(xì)胞LTEP-s
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞LTEP-sm
人肺鱗癌瘤株LTEP-s
人肺腺癌細(xì)胞LTEP-a-2
人肺腺癌細(xì)胞Lu-165
