中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述
無菌操作基本技術(shù)
1. 實驗進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺（laminar flow） 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個細(xì)胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進(jìn)行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺（至少Class II）。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。
5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)（300 小時/預(yù)濾網(wǎng),3000 小時/HEPA）。
6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水。
實驗用品
1. 種類︰
1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。
1.2. TC 級培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene （PP） 為不透明材質(zhì)，polystyrene （PS） 為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。
1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware）：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml
2. 清洗︰
2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。
2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌︰
3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。
3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170 oC, 4 小時。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水） 或是蒸汽高壓滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘處理。
中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 oC 冰箱，避免光照，實驗進(jìn)行前放在37 oC 水槽中溫?zé)帷?/div>
2. 液體培養(yǎng)基（加血清） 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細(xì)胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制（以1 升為例）：
3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強酸（HCl）或強堿（NaOH），因為氯離子對細(xì)胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。
3.2. 材料：
3.2.1. 純水（milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要）
3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
3.2.3. NaHCO3 （Sigma S-4019）
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末（數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一）溶于200mlmilli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后 溶液之pH 應(yīng)為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。 若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4 oC。（血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾）
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。
4. 配制培養(yǎng)基之生長測試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell （ATCC CCL-34 或CCRC 60004）
4.1.2. 6-well TC plate （or 35 mm TC dish）
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution （GibcoBRL 10092-013）
中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO
中國倉鼠卵巢細(xì)胞 K1（亞系克隆）CHO-K1
中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO/dhFr
倉鼠卵巢細(xì)胞二氫葉酸還原酶缺陷CHO/dhFr-
中國倉鼠卵巢細(xì)胞CTLA4 Ig-24
牛胚氣管細(xì)胞EBTr （NBL-4）
倉鼠卵巢細(xì)胞Lec1
雞胚成纖維細(xì)胞UMNSAH/DF-1
豚鼠胚胎細(xì)胞104C1
中國倉鼠卵巢細(xì)胞7WCY1.0
中國倉鼠卵巢細(xì)胞7WD10
中國倉鼠卵巢細(xì)胞7WML6.0
中國倉鼠卵巢細(xì)胞7WPS1
小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3
正常小鼠睪丸 Sertoli細(xì)胞TM4
昆蟲卵巢細(xì)胞SF9
豬胎睪丸傳代細(xì)胞ST
中國倉鼠卵巢細(xì)胞（亞系克隆）CHO-HCV-C
興國鯉尾鰭細(xì)胞XGL
猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜（內(nèi)皮）細(xì)胞RF/6A
新生牛眼晶體上皮細(xì)胞NBLE
新生牛眼 Tenon's囊成纖維細(xì)胞NBTF
鼠舌黏膜鱗癌細(xì)胞Rca-T
鼠頰黏膜鱗癌細(xì)胞Rca-B
幼蚊細(xì)胞C6/36
大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383
大鼠氣管上皮細(xì)胞RTE
大鼠肺成纖維樣細(xì)胞RL1
大鼠肺細(xì)胞WTRL1
大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞A7r5
大鼠心肌細(xì)胞H9c2（2-1）
大鼠肝細(xì)胞瘤H-4-Ⅱ-E
大鼠肝細(xì)胞IAR20
大鼠肝細(xì)胞瘤H4-Ⅱ-E-C3
大鼠肝細(xì)胞BRL
大鼠肝細(xì)胞BRL 3A
大鼠肝癌細(xì)胞RH-35
大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC-12
正常大鼠腎細(xì)胞NRK
大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1
大鼠腎細(xì)胞RK1
大鼠腎細(xì)胞NRK-52E
大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（低分化）PC-12
大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（高分化）PC-12
