RNAi是由雙鏈RNA 所引起的序列特異性基因沉默。RNAi 首先由Fire 等發現于秀麗隱桿線蟲(C. elegans) 中, 他們發現將dsRNA 注入線蟲體內后可抑制序列同源基因的表達, 并證實這種抑制主要作用于轉錄之后, 所以又稱RNAi 為轉錄后基因沉默( postt ranscriptional gene silencing ,PTGS) 。隨后人們陸續在果蠅(Drosophila) 、錐蟲( Trypanosomes) 、渦蟲( Planaria) 、斑馬魚( Zebrafish) 、擬南芥(Arabidopsis thaliana) 、大小鼠和人體內發現了RNAi 現象, 遺傳學研究表明RNAi 是真核生物中一種普遍存在且非常保守的機制, 與真核細胞中許多重要生物學過程密切相通過對RNAi 現象的遺傳學與生物化學研究,其作用機制已日漸清晰(見圖1) 。Zamore 等利用果蠅胚胎提取物建立的體外系統, 證實RNAi 是一個依賴ATP 的過程, 在此過程中, dsRNA (外源的或體內產生的) 首先被降解為具5"2單磷酸、長21～23bp 的小分子雙鏈RNA , 這種RNA 分子稱為小干擾RNA , siRNA 通過堿基互補配對識別具同源序列的mRNA , 并介導其降解。研究表明在生物體中siRNA 具相似的結構特征: 為長約21～23bp 的雙鏈RNA , 具5"單磷酸和3"羥基末端, 互補雙鏈的3"端均有一個2～3nt 的單鏈突出。在RNAi 過程中一種稱為Dicer 的核酸酶負責將dsRNA 轉化為siRNA , 它屬于RNase Ⅲ家族,具有兩個催化結構域、一個解旋酶( helicase) 結構域和一個PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 結構域, Dicer 在催化過程中以二聚體的形式出現, 其催化結構域在dsRNA 上反平行排列, 形成四個活性位點, 但只有兩側的兩個位點有內切核酸酶活性, 這兩個位點在相距約22bp 的距離切斷dsRNA , 各種生物體內Dicer 結構略有不同, 致使siRNA 長度存在微小差別。siRNA 形成之后, 與一系列特異性蛋白結合形成siRNA 誘導干擾復合體( siRNA induced interference complex , RISC) , RNA干擾技術的原理和應用此復合物通過堿基互補配對識別靶mRNA 并使其降解, 從而導致特定基因沉默。在RISC 中, 起靶序列識別作用的是siRNA的反義鏈 , Zamore 等發現在RNAi 過程中,首先產生的是RISC 無活性前體, 分子量～250kD ,當加入ATP 后可形成100kD 的活性復合體。由無活性前體向活性酶復合物的轉換類似蛋白酶原的激要求結合于其上的siRNA 雙鏈的解開。在ATP 存在時, 依賴于ATP 的解旋酶解開siRNA 的雙鏈并將其正義鏈與靶mRNA 置換, mRNA 取代正義鏈與反義鏈互補, 然后由活化的RISC 在互補區的中間, 距離siRNA 反義鏈3"末端約12bp 處切斷靶mRNA 序列。RNAi 效應具有兩個明顯的特征, 特異性和性。干擾的性提示在機制中存在信號放大的步驟。Fire 等早在1998 年便發現少量的dsRNA就能夠導致線蟲大量的靶mRNA 降解, 但單憑少量dsRNA 被Dicer 降解為幾十個siRNA 并不能解釋這種性。許多研究顯示RNAi 過程中有新的dsRNA 分子的合成, 當siRNA 反義鏈識別并結合靶mRNA 后, siRNA 反義鏈可作為引物, 以靶mRNA 為模板在依賴于RNA 的RNA 聚合酶(RNA2dependent RNA polymerase , RdRP) 催化下合成新的dsRNA , 然后由Dicer 切割產生新的siRNA , 新siRNA 再去識別新一組mRNA , 又產生新的siRNA , 經過若干次合成切割循環, 沉默信號就會不斷放大(圖1) 。正是這種稱為靶序列指導的擴增( target2directed amplification) 機制賦予了RNAi 的性和持久性。