棉花組織RNA 的提取是進(jìn)行棉花分子生物學(xué)研究的必要前提。進(jìn)行Northern 雜交分析、體外翻譯、建立cDNA 文庫(kù)、RT2PCR 及差異顯示分析等研究都需要高質(zhì)量的RNA (李宏和王新力,1999 ; 趙雙宜等, 2002) 。棉花組織中富含多糖、多酚等次生代謝物質(zhì), 在提取過(guò)程中, 多糖易與分子植物育種,2004 年,第2 卷,第1 期,第147 —150 頁(yè)molecular Plant Breeding ,2004 ,Vol12 , ,147 —150 　RNA 共沉淀, 多酚類物質(zhì)極易被氧化成紅褐色物質(zhì), 然后與核酸不可逆的結(jié)合, 對(duì)RNA 的提取造成干擾。RNA 極易受到RNA 酶的影響而降解以及受到蛋白質(zhì)、DNA 等的污染而降低RNA 的質(zhì)量(Woodhead et al1 , 1997 ; Maliyakal , 1992 ) 。目前用于RNA 提取的試劑盒雖然操作簡(jiǎn)便、能快速提取植物組織RNA , 但其價(jià)格昂貴, 提取成本較高。本試驗(yàn)針對(duì)一些主要影響因素, 對(duì)快速簡(jiǎn)便提取棉花組織RNA 的方法進(jìn)行了探索。

1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 供試材料: 棉花品種為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花育種研究室培育的“農(nóng)大94 - 7", 試驗(yàn)所用葉片、根、纖維、花冠、種子均取自新鮮組織。
1.1.2 試驗(yàn)藥品: 異硫氰酸胍( Guanidine Thio-cyanate) 、丙烷磺酸(Moropholino ethanesulfonic acid ,MOPS) 、焦碳酸乙酯(Diethyl Pyrocarbonate , DEPC) 、β- 巰基乙醇(β- Mercaptoethanol) 購(gòu)自Amresco 公司, 溴代十六烷基*烷(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide , CTAB) 、聚乙烯吡咯烷酮(PolywinyPyrro-lidone40 , PVP40) 、三羥基甲烷( TRIS) 、乙二胺四乙酸(Ethylenediamine teraacetic acid , EDTA) 等均購(gòu)自Sigma 公司, 為超純進(jìn)口試劑, 其它試劑為一般分析純化學(xué)試劑。
1.2 方法
1.2.1 試劑配制:
RNA 提取緩沖液: 4Mol·L - 1異硫氰酸胍, 0.1Mol·L - 1 Tris 堿(pH815) , 114 Mol·L - 1NaCl , 0.02Mol·L - 1 EDTA , 2 %CTAB , 2 %PVP40 , 1 %β- 巰基乙醇。
MOPs 緩沖液( 10 ×) : 0.4 Mol ·L - 1 MOPs(pH710) , 0.1 Mol·L - 1NaAc , 0.1 Mol·L - 1EDTA 。上樣染料: 50 %甘油, 1 Mol ·L - 1 EDTA ,0.4 %溴酚藍(lán), 0.4 %二甲苯青。
其它試劑: 均需用DEPC 處理過(guò)的水配制,經(jīng)高溫滅菌待用, 或?yàn)樾麻_(kāi)封專門用于提取RNA的試劑。所用試劑瓶、電泳槽也需是無(wú)RNA 酶污染的, 一次性使用的塑料制品如槍頭、離心管等可經(jīng)高溫滅菌后直接使用。
1.2.2 提取步驟
取1g 左右的棉花新鮮組織加入液氮迅速研磨成均勻的粉末, 轉(zhuǎn)入10mL 離心管中, 加入3mL預(yù)冷的RNA 提取緩沖液混勻, 置于冰上; 每管依次加入3 Mol·L - 1 NaAc200μL , 酸酚3mL , 氯仿:異戊醇600μL ( 每加一種試劑都要輕搖混合均勻) , 冰浴15min ; 4 ℃條件下, 5 300rpm 離心30min , 吸上清于另一離心管中, 加入等體積氯仿: 異戊醇混勻; 4 ℃條件下, 5 300rpm 離心20min , 吸上清加入等體積的異丙醇混勻后置于-20 ℃冰箱冷凍1h 以上; 4 ℃條件下, 5 300rpm 離心30min , 去上清, 用70 %乙醇清洗2～3 次, 并轉(zhuǎn)入115mL 離心管中, 干燥后溶于適量DEPC 水中, 取1μL 進(jìn)行檢測(cè), 其余- 70 ℃冰箱中保存。